第三节　荧光染料浓度

在荧光染色过程中，必须确定所用荧光染料的浓度是否与荧光强度有直接的比例关系。当染料浓度较低时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大。当荧光染料达到一定浓度后，如继续增加浓度，不仅不会使荧光信号再有相应的增强，反而会使荧光强度下降。这种因浓度增大会使量子产率减少，荧光染料的浓度与其量子产率之间的这种关系，称为浓度猝灭（concentration quenching）。

在生物物理学中，荧光强度、量子产率和荧光染料浓度之间的关系有等式：F=KφεI₀（1−e−εlC），其中F是荧光强度，K是仪器常数，φ是量子产率，I₀是激发光强度，ε是克分子消光系数，l是样品池光径，C是荧光染料的浓度。只有当荧光染料的浓度处于很稀的浓度时，F=KI₀φ•［1−（1−εlC）］=KI₀φεlC。因此，切记荧光染料的浓度过高时，荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。

为什么会发生浓度猝灭现象呢？当前能够做出的解释是：当荧光染料处于稀释时，荧光染料分子之间的相互作用几乎完全消失，量子产率最大，荧光强度的发射最强。当溶液浓度增加时，荧光染料分子之间发生碰撞的概率增加，单线能级的激发分子在发出荧光之前很容易与未激发的荧光分子碰撞，形成二聚体或多聚体，使量子产率下降；同时，各能级之间的干扰明显增加，降低了处于激发态电子的稳定性，缩短了电子处于激发态的时间，造成非辐射跃迁的概率增加，也可引起量子产率下降；另外，荧光染料浓度过高时，造成荧光分子在溶剂中的分布不均匀，靠近入射光面的溶液吸收光强，而进入溶液深层时，光吸收越少，发出荧光的分子也越少，出现所谓的内滤光效应（inter filter effect）。

因此，流式细胞术在荧光染色过程中，必须事先确定所用荧光染料的浓度是否与荧光强度有直接的比例关系，以选择最合适的染色浓度。实际工作中，可以通过检查所得到的荧光值来判断所用荧光染料的浓度是该染料浓度-荧光强度曲线达到峰值前的浓度，还是峰值后的浓度，原则上应采用峰值前浓度进行检验。简便的判断方法是：略微减少荧光染料溶液的加入量，若上机测定得到的荧光强度减弱则为峰值前浓度。